摘要 通過體外模擬糖尿病患者高血糖環(huán)境研究胎盤間充質(zhì)干細胞(placenta mesenchymal stem cells, PMSCs)促進角質(zhì)形成細胞的增殖和遷移能力, 這對闡明PMSCs促進糖尿病足等皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的作用具有重要意義。該研究分離培養(yǎng)人角質(zhì)形成細胞(human keratinocytes, hKCs), 添加 50~100 mmol/L葡萄糖, 建立高糖損傷模型。利用CCK-8檢測損傷hKCs與PMSCs共培養(yǎng)前后的增殖情況, 流式細胞術(shù)檢測細凋亡胞數(shù)量, 細胞劃痕愈合實驗檢測細胞遷移速度, 免疫熒光染色和 Western blot檢測細胞骨架蛋白波形蛋白(vimentin)的表達, 以反映細胞的形態(tài)和運動能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 原代hKCs為大小均一的鋪路石樣細胞, 在模擬高血糖環(huán)境(50 mmol/L、100 mmol/L D-葡萄糖) 時, 細胞出現(xiàn)扁平、增大、增殖能力下降等衰老特點, 角質(zhì)形成細胞增殖率低, 遷移區(qū)域稀疏。與對照組相比, PMSCs共培養(yǎng)組在高糖條件下hKCs生長速度快, 增殖率高, 凋亡率低, 遷移覆蓋面積較大, 波形蛋白表達明顯增強, 形態(tài)發(fā)生間質(zhì)樣轉(zhuǎn)變。以上結(jié)果說明, PMSCs不僅能夠抑制高糖引起的人角質(zhì)形成細胞凋亡, 同時促進其增殖和遷移, 為間充質(zhì)干細胞促進皮膚創(chuàng)面愈合的基礎(chǔ)與臨床研究提供了新證據(jù)。

　　關(guān)鍵詞 胎盤間充質(zhì)干細胞; 人角質(zhì)形成細胞; 增殖; 遷移; 高糖; 皮膚創(chuàng)面愈合

　　糖尿病性慢性難愈合創(chuàng)面嚴(yán)重影響患者健康和生活質(zhì)量, 甚至發(fā)生致殘、潰瘍癌變等危及患者生命的嚴(yán)重并發(fā)癥。影響糖尿病創(chuàng)面愈合過程的因素包括: 受損的角質(zhì)細胞遷移和增殖[1]、縫隙連接異常[2]、慢性炎癥[3]、血管生成受損[4]、氧化應(yīng)激增加[5]以及基質(zhì)金屬蛋白酶的異常表達[6]。表皮角質(zhì)形成細胞的生理功能紊亂在糖尿病創(chuàng)面愈合不良中起著重要的作用。慢性高血糖引起的表皮角質(zhì)形成細胞的氧化應(yīng)激損傷、蛋白活性改變等, 嚴(yán)重影響細胞的增殖、分化、運動等生物學(xué)功能, 使?jié)儽砻娼?jīng)久不愈。我們前期的研究發(fā)現(xiàn), 人胎盤間充質(zhì)干細胞(placenta mesenchymal stem cells, PMSCs)能夠明顯促進小鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面的愈合、促進血管內(nèi)皮細胞和肌細胞的再生, 但其作用機制仍不明確。本研究利用體外培養(yǎng)的原代表皮基底細胞制備高糖損傷模型, 通過與PMSCs的共培養(yǎng), 闡明PMSCs促進糖尿病潰瘍皮膚創(chuàng)面愈合的細胞學(xué)機制。本研究對促進糖尿病足等難愈性創(chuàng)面愈合, 降低糖尿病足病患者的截肢率具有重要意義, 可為慢性糖尿病創(chuàng)面的治療和管理提供更有效和個性化的治療策略。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 人體組織來源 正常人皮膚組織來源于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院泌尿外科行包皮環(huán)切手術(shù)后廢棄皮膚, 胎盤來源于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院產(chǎn)科分娩產(chǎn)婦及家屬捐贈, 經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)且獲得患者知情同意。

　　1.1.2 主要試劑及儀器

　　CELLnTEC表皮細胞培養(yǎng)基購自CELLnTEC公司; MesenCult™-XF Medium無血清培養(yǎng)基購自Stemcell公司; TrypLE Express消化酶、DNase I酶、Annexin V/FITC凋亡檢測試劑盒購自ThermoFisher公司; II型dispease酶購自Roche公司; CCK-8試劑購自Transgen Biotech公司; 倒置熒光顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品; CO2培養(yǎng)箱為ThermoFisher公司產(chǎn)品; 酶標(biāo)儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 胎兒來源的胎盤間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)取新鮮胎盤組織, 利用剪刀分別小心避開血管, 剪取胎盤絨毛膜組織, 清洗后, 利用眼科剪機械破碎組織, 收集剪碎后的組織加入30 mL DMEM并加入 A型膠原酶和DNase I酶, 37 °C水浴消化2 h, 待消化完畢后將離心管置于離心機中按1 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心, 用PBS重懸沉淀物, 先后用100 μm、40 μm細胞篩過濾沉淀, 收集過濾后所得細胞懸液, 離心后用 MesenCult™-XF Medium無血清培養(yǎng)基重懸, 接種于10 cm無菌培養(yǎng)皿中, 置于37 °C、5% CO2條件下培養(yǎng), 每隔2天換液1次, 此細胞即為P0代。顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài), 待細胞達70%~80%融合狀態(tài)時, 利用TrypLE消化后按1?3傳代, 繼續(xù)培養(yǎng)至P3代作為實驗用細胞。

　　1.2.2 hKCs分離培養(yǎng) 取環(huán)狀切除術(shù)后正常人包皮皮膚, 將組織先后在碘伏與75%的乙醇中消毒, 并在含1%抗生素的PBS中進行漂洗; 剔除皮下脂肪層、血管、結(jié)締組織, 剪成1 cm×1 cm小塊, 置于3.3 mg/ mL dispase II中, 4 °C消化14 h, 機械分開表皮與真皮層。將表皮置于離心管中, 加入0.25%胰酶5 mL, 在 37 °C孵箱中消化15 min。加DMEM+10% FBS終止消化, 1 500 r/min離心5 min, 棄上清, 加入無血清角化培養(yǎng)基, 在斡旋器上瞬時震蕩。70 μm無菌濾網(wǎng)過濾, 吸取單細胞懸液, 3×106 接種在已包被0.1% I型牛膠原的培養(yǎng)皿中, 置于37 °C、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞長成70%~80%融合狀態(tài)時, 用TrypLE消化細胞5 min, PBS稀釋消化液終止消化, 吹打混懸, 離心收集細胞, 加培養(yǎng)基, 轉(zhuǎn)移至I型膠原包被好的培養(yǎng)皿內(nèi), 繼續(xù)培養(yǎng)至P2代, 每2天換液。

　　1.2.3 高糖損傷細胞模型構(gòu)建 正常hKCs培養(yǎng)基含葡萄糖12.5 mmol/L, 在此基礎(chǔ)上添加D-葡萄糖(Dglucose), 使培養(yǎng)基中葡萄糖終濃度達到25 mmol/L、 50 mmol/L和100 mmol/L, 培養(yǎng)72 h后進行后續(xù)PMSC 條件培養(yǎng)基培養(yǎng)、劃痕、凋亡等實驗。

　　1.2.4 條件培養(yǎng)基的制備 1×106 的PMSCs貼壁培養(yǎng)12 h后, 換hKCs培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h收集培養(yǎng)上清, 0.45 μm濾膜過濾, 作為條件培養(yǎng)基繼續(xù)用于 CCK-8檢測hKCs細胞增殖。

　　1.2.5 共培養(yǎng)系統(tǒng) 利用膜孔徑為0.4 μm的Transwell小室進行兩種細胞共培養(yǎng), 下室接種hKCs, 上室接種PMSCs, 共培養(yǎng)于含2%人血小板裂解物的 CELLnTEC表皮細胞培養(yǎng)基中, 各組分別添加不同濃度的葡萄糖。共培養(yǎng)72 h后, 用流式細胞分析 hKCs細胞凋亡, 免疫熒光分析vimentin蛋白表達, 劃痕愈合實驗分析細胞遷移能力。

　　1.2.6 CCK-8檢測細胞增殖 以TrypLE Express消化處于對數(shù)生長期的人hKCs, 細胞計數(shù)板計數(shù), 以每100 μL接種于96孔板中(細胞密度3 000個/孔), 在 37 °C、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后, 即細胞貼壁后, 兩組各取6孔細胞, 每孔加入10 μL CCK-8溶液, 繼續(xù)在37 °C恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h后, 酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處各孔的D值。96孔板置于37 °C、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1~7天, 每24 h測6個復(fù)孔, 并設(shè)無細胞的空白對照組。上述實驗均重復(fù)3次, 結(jié)果取平均值。根據(jù)公式計算各組細胞群體倍增時間, Td=δt×lg2/(lgNt–lgN0)。

　　1.2.7 流式法檢測細胞凋亡 收集正常培養(yǎng)、高糖培養(yǎng)和高糖損傷后再與PMSCs共培養(yǎng)的各組細胞, 消化離心后, PBS漂洗1次, 按Annexin V-FITC流式細胞分析試劑盒說明染色, 染色后, PBS漂洗1次, 上流式細胞儀分析細胞Annexin V和FITC陽性率。

　　1.2.8 劃痕愈合試驗 培養(yǎng)板背面畫橫線標(biāo)記, 拍照時方便定位同一個視野。細胞鋪滿板底后, 用10 μL 槍頭垂直于孔板制造細胞劃痕, 盡量保證各個劃痕寬度一致。吸去細胞培養(yǎng)液, 用PBS沖洗孔板3次, 洗去劃痕產(chǎn)生的細胞碎片。加入無血清培養(yǎng)基, 每 12 h拍照記錄, 根據(jù)收集圖片數(shù)據(jù)分析細胞覆蓋面積和劃痕面積。

　　1.2.9 免疫熒光染色 各處理組細胞經(jīng)40 g/L多聚甲醛固定30 min, 3 mL/L Triton X-100細胞膜穿孔10 min, 根據(jù)二抗選擇兔血清封閉, 次序與單克隆抗體 vimentin(1?200)一抗以及Alexa Fluor 488標(biāo)記兔抗鼠二抗(1?1 000)孵育、洗滌, DAPI染核, 倒置熒光顯微鏡下觀察細胞特異性發(fā)光情況, Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行陽性細胞計數(shù)。

　　1.2.10 Western blot 分析 RIPA裂解液提取樣本總蛋白, BCA法測定蛋白質(zhì)濃度, 等量上樣, SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白, 濕法轉(zhuǎn)膜后, 5%脫脂奶粉封閉1 h, 次序與一抗(4 °C過夜)、二抗孵育(室溫30 min), 利用ECL法檢測目的蛋白條帶, 灰度掃描后分析蛋白質(zhì)表達水平的差異。使用Image Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件進行圖像分析, 用GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化蛋白表達量。

　　1.2.11 統(tǒng)計學(xué)處理 所有實驗進行了3次重復(fù)。數(shù)據(jù)由SPSS 17.0或GraphPad軟件統(tǒng)計分析, 以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(x _ ±s)表示應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗結(jié)果進行單因素方差分析或雙因素方差分析, P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

　　2 結(jié)果

　　2.1 高糖損傷細胞模型建立及胎盤間充質(zhì)干細胞對hKCs增殖的影響

　　12.5、25、50、100 mmol/L的D-glucose分別處理原代分離的hKCs 72 h后于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。隨著D-glucose濃度的升高, 細胞形態(tài)發(fā)生了顯著變化(圖1)。對照組細胞為多邊形, 隨著培養(yǎng)時間的延長細胞數(shù)量增多; 12.5 mmol/L和25 mmol/L D-glucose處理細胞72 h后, 細胞仍然處于增殖狀態(tài), 細胞形態(tài)基本無變化(圖1A和圖1B); 50 mmol/L D-glucose處理組部分細胞折光性降低, 胞體變大, 細胞胞體中出現(xiàn)空洞(圖1C); 100 mmol/L處理組大部分細胞變大, 邊緣模糊, 少量細胞失去貼壁性, 細胞周圍有典型凋亡小體溢出(圖1D)。

　　進一步采用CCK-8法檢測了高濃度D-glucose 對hKCs 7天內(nèi)的生長抑制作用以及胎盤間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基對hKCs增殖抑制的影響(圖2)。 50~100 mmol/L D-glucose對細胞有一定的細胞毒活性, 細胞增殖在處理24 h后明顯被抑制(圖2A), 群體倍增時間(PDT)較12~25 mmol/L葡萄糖濃度培養(yǎng)顯著延長(P<0.05)(圖2B)。而同樣糖濃度下, 使用胎盤間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)24 h后的培養(yǎng)基培養(yǎng)的hKCs 在 第5~7天, 增殖較50~100 mmol/L D-glucose對 照組明顯增加, 其他時間點沒有顯著差異。從群體倍增時間來看, PMSC-CM培養(yǎng)的hKCs的PDT減少, 25 mmol/L葡萄糖組差異顯著(P<0.05), 其他差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2B)。

　　2.2 胎盤間充質(zhì)干細胞對hKCs凋亡的影響

　　12.5、25、50、100 mmol/L D-glucose處理 hKCs 72 h后, 收集細胞進行Annexin V/FITC雙染流式檢測, 其結(jié)果顯示, 不同濃度D-glucose處理后, 50、 100 mmol/L D-glucose組凋亡細胞數(shù)量增加, 達到極顯著水平(P<0.01)(圖3和表1)。與胎盤間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)后, 50~100 mmol/L葡萄糖處理的細胞, 凋亡細胞數(shù)量顯著低于未進行共培養(yǎng)的高糖損傷組 (P<0.05), 而12.5~25 mmol/L D-glucose處理組, 共培養(yǎng)前后凋亡細胞數(shù)差異不顯著。

　　2.3 胎盤間充質(zhì)干細胞對hKCs遷移的影響

　　劃痕法觀察細胞的遷移情況, Image Pro Plus 軟件計算劃痕區(qū)域的面積(以像素計算)。對照組細胞在培養(yǎng)24 h后逐漸向劃痕遷移, 48 h后大部分細胞已遷移至劃痕處, 并越過劃痕形成兩界融合(圖 4A)。與12.5 mmol/L和25 mmol/L D-glucose組相比, 50 mmol/L和100 mmol/L葡萄糖處理hKCs 24 h和48 h后均顯示了較強的遷移抑制作用(P<0.01)。同時, 與 PMSCs共培養(yǎng)對細胞的遷移有顯著的促進作用, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4B)。

　　2.4 胎盤間充質(zhì)干細胞對hKCs波形纖維蛋白的影響

　　波形蛋白(vimentin, Vim)是一種III型中間絲(intermediate filament, IF)蛋白, 與細胞貼附性和運動性密切相關(guān), 常被用作間質(zhì)衍生細胞或細胞在上皮–間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標(biāo)記。我們采用熒光二抗標(biāo)記的免疫化學(xué)實驗觀察細胞形態(tài)變化(圖5A)。正常培養(yǎng)的hKCs, 波形蛋白分布聚集在細胞核周圍, 細胞以多邊形為主。胎盤間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)72 h后, 沿細胞縱軸伸展出片狀偽足及絲狀偽足, 并相互接觸形成細胞間連接, 細胞形態(tài)向間質(zhì)樣轉(zhuǎn)變。Western blot方法定量蛋白表達, 結(jié)果顯示, 與PMSCs共培養(yǎng)后, vimentin 相對GAPDH蛋白表達上調(diào)(圖5B), 相對灰度值統(tǒng)計結(jié)果差異顯著(圖5C)。

　　3 討論

　　糖尿病患者創(chuàng)面愈合損傷是一個重要的臨床問題。適當(dāng)?shù)慕腔毎w移和增殖是再上皮化的關(guān)鍵步驟, 這些自我修復(fù)過程在糖尿病(DM)中可能由于高血糖和傷口部位的慢性炎癥而受損[1]。本研究探討了高糖的類糖尿病微環(huán)境對人角質(zhì)形成細胞體外遷移和增殖的影響以及胎盤來源間充質(zhì)干細胞對高糖損傷的逆轉(zhuǎn)作用。高糖通過Erk信號通路以活性氧(ROS)依賴的方式刺激大鼠角質(zhì)形成細胞遷移和增殖[7]。高血糖環(huán)境導(dǎo)致蛋白質(zhì)的非酶糖基化增多, 如膠原蛋白的糖基化使角質(zhì)形成細胞對糖基化I 型膠原的黏附和遷移減少。角質(zhì)形成細胞中影響遷移的關(guān)鍵作用分子Gal-7基因的O-乙酰氨基葡萄糖 (O-GlcNAc)修飾增加, 降低了Gal-7的表達[8]。還有研究證明, 高糖通過抑制PI3K信號通路抑制ClC-2 氯離子通道, 減弱大鼠角質(zhì)形成細胞的遷移[9]。基質(zhì)金屬蛋白酶的異常表達也可能會導(dǎo)致角質(zhì)形成細胞遷移受損, 導(dǎo)致糖尿病傷口的延遲愈合[6]。此外, 研究也顯示, 角質(zhì)形成細胞功能障礙可能是由高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激引起的[10-11]。動物實驗進一步證實, 氧化應(yīng)激參與了糖尿病難愈合創(chuàng)面的形成, 口服抗氧化劑可以調(diào)節(jié)糖尿病小鼠的炎癥過程, 增強創(chuàng)面愈合[12]。以上研究表明, 多種機制導(dǎo)致了角質(zhì)形成細胞在糖尿病中的增殖和遷移減少。本研究結(jié)果同樣顯示, 高糖會損害hKCs的增殖和遷移; 同時還表明, 與胎盤間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)有利于恢復(fù)hKCs的增殖和遷移能力。已有的報道對高糖濃度的界定從25~100 mmol/L不等, 多數(shù)報道顯示, 30~50 mmol/L 葡萄糖會造成細胞損傷, 根據(jù)細胞類型不同存在差異[7,10,13]。本研究發(fā)現(xiàn), 在25 mmol/L高糖培養(yǎng)下, 細胞增殖、凋亡和運動能力較12.5 mmol/L(正常hKCs培養(yǎng)基糖濃度)糖培養(yǎng)沒有明顯的差異。隨著糖濃度增加到50 mmol/L, hKCs增殖和運動能力都降低, 凋亡細胞比例升高。Buranasin等[10]也報道, 成纖維細胞在 50 mmol/L和75 mmol/L葡萄糖時, EdU染色陽性的細胞數(shù)量和細胞活力均下降, 高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激會損害人牙齦成纖維細胞的增殖和遷移。雖然50 mmol/L 的糖濃度遠遠高于人糖尿病病理生理糖濃度, 但本研究中使用50 mmol/L的糖濃度才可檢測到細胞損傷, 這可能與細胞體外培養(yǎng)環(huán)境和檢測方法有關(guān)。

　　MSCs主要依賴于生長因子、細胞因子和外泌體等旁分泌效應(yīng)對損傷組織起修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)作用[14-16]。研究發(fā)現(xiàn), 移植骨髓MSCs可以改善糖尿病大鼠的受損愈合過程, 這與減緩hKCs中pFAK水平下降以及MMP2、EGF、IGF-1水平升高有關(guān)[17]。用骨髓間充質(zhì)干細胞治療大鼠角化細胞可以減少高糖誘導(dǎo)的ROS過量產(chǎn)生, 逆轉(zhuǎn)了由高糖誘導(dǎo)的MEK1/2 和Erk1/2磷酸化的下調(diào)[7]。Kato等[17]的研究發(fā)現(xiàn), 移植BM-MSCs可以改善糖尿病大鼠的受損愈合過程, 在MSC-CM培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞中, 高糖條件下 pFAK水平降低恢復(fù), MMP2、EGF、IGF-1水平升高。胎盤間充質(zhì)干細胞也具有來源廣泛、取材方便、低免疫原性以及可自體移植等優(yōu)勢。已有研究發(fā)現(xiàn), 胎盤來源MSCs可顯著促進傷口的愈合速度和血管數(shù)量[18]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn), 絨毛膜來源的PMSCs表達高水平的CD200和HGF。與HGF、 CD200陰性PMSCs相比, HGF、CD200陽性細胞在體外促進血管生成、提高小鼠體內(nèi)免疫抑制功能方面具有顯著的潛力[19]。本研究驗證了PMSCs對高糖誘導(dǎo)的hKCs損傷的修復(fù)作用, 實驗發(fā)現(xiàn), 高糖損傷的hKCs與PMSCs共培養(yǎng)(或條件培養(yǎng))后凋亡細胞明顯減低、增殖顯著增加, 并且顯著促進了hKCs的遷移, 細胞形態(tài)發(fā)生明顯間質(zhì)樣轉(zhuǎn)變, 細胞骨架蛋白 vimentin表達顯著上調(diào)。Vimentin在間充質(zhì)細胞中形成中間絲, 促進細胞的上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化, 被作為腫瘤進展的標(biāo)記[20]。這些結(jié)果表明, PMSCs可以緩解高糖環(huán)境造成的hKCs增殖緩慢, 且促進hKCs的再生和運動能力。但PMSCs究竟通過何種蛋白和信號通路發(fā)揮促細胞遷移作用機制還需進一步研究。本研究在體外水平獨立分析了高糖條件下PMSCs對人角質(zhì)形成細胞的功能影響,幼兒護理論文兇險型前置胎盤合并胎盤植入，為胎盤間充質(zhì)干細胞對難愈合皮膚損傷的治療提供了一定的研究基礎(chǔ)。

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