摘要：運用正交設計L9（34）與多指標綜合加權分析方法優化3種益生復合菌發酵豆粕的工藝，采用接種量（A）、環境溫度（B）、料水比（C）、發酵菌種（D）為處理因素，以還原糖、乳酸、氨基酸含量等作為綜合評價指標，利用Minitab17軟件以及多指標試驗公式法進行加權數據處理，優化豆粕的固體發酵工藝參數。結果顯示，1）經過加權分析，中性蛋白酶權重系數最高，其次為還原糖（1.719）和乳酸（1.590），粗脂肪權重系數最低。說明本試驗中性蛋白酶、還原糖以及乳酸對發酵豆粕的品質影響較大。2）通過綜合評分公式對9個處理組數據分析得到：T9組綜合評分最高（0.9863），T1組（0.9654）和T8組（0.9626）次之，表明在T9組合（A3B3C2D1）條件下發酵豆粕，所選8項考察指標綜合水平達到最高。因此擬選T9組合為最佳發酵工藝組合；3）均值回應表顯示影響豆粕發酵工藝的因素依次為：發酵菌種>料水比>環境溫度>接種量，其中發酵菌種和料水比為顯著影響因素（P<0.05），而接種量和環境溫度對試驗結果影響不顯著。從資源節約以及生產實際角度考慮，將T9組發酵工藝A3B3C2D1優化為A1B2C2D1，即接種質量分數1%，環境溫度30℃，料水比質量為2∶1，發酵菌種配比為1∶1∶1。4）Minitab17軟件對優選工藝A1B2C2D1進行預測，結果顯示優選工藝綜合評分高于擬選工藝A3B3C2D1綜合評分（0.9863）。驗證試驗得出各指標產出與預期結果相符，表明該優化工藝合理、可行，各指標產出率較高，為豆粕發酵工藝的確定提供了參考依據。

　　關鍵詞：飼料；農產品加工；發酵；綜合加權分析法；正交試驗；發酵豆粕

　　0引言

　　水產養殖業發展對魚粉需求量逐年增大，加之餌料漁業資源捕撈過度，導致魚粉價格不斷升高，因此，用植物蛋白代替魚粉等動物蛋白頗受關注[1-4]。豆粕是大豆加工后得到的一種副產品，含有豐富的蛋白質，是水產飼料行業應用最廣泛的植物蛋白源[5-8]，但由于豆粕中的抗營養因子、氨基酸不平衡、結構致密造成的適口性差和消化率偏低等限制了其應用價值。許多研究表明，有益微生物發酵豆粕可以降低抗營養因子含量，提高動物生長速度，改善養殖動物腸道菌群，增強免疫功能[9]；大分子蛋白質也可以在微生物作用下降解為容易被養殖動物吸收的多肽、小肽及游離氨基酸[10]；微生物發酵也可以降解部分碳水化合物，使豆粕致密結構變得疏松，減少苦味的產生[11]，從而增加豆粕適口性，提高水產動物的飼料利用率[12-13]。毛銀等[14]采用一株植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）進行豆粕發酵研究，產物中含有6種有機酸，改善了豆粕的氣味性和適口性，還可以防止豆粕變質。Li等[15-16]采用正交試驗設計開展了枯草芽孢桿菌ZC1發酵豆粕的培養基以及培養條件優化研究，研究發現在攪拌速率150r/min、通氣量5L/min、環境溫度37℃時，中性蛋白酶酶活力和大豆肽轉化率分別達到了852.5U/mL和76.73%。

　　1材料與方法

　　1.1材料

　　1.1.1發酵菌種枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）NHS1，1.5×109cfu/mL；乳酸菌NHS03（Lacticacidbacteria），2×109cfu/mL；海洋紅酵母菌NHS05（Marineredyeast），8×108cfu/mL，3種菌種均由中國水產科學研究院南海水產研究所分離，鑒定并保藏。

　　1.1.2發酵底物豆粕（東莞市富之源飼料蛋白開發有限公司）1.2方法1.2.1正交試驗設計以接種量（A）、環境溫度（B）、料水比（C）、發酵菌種（D）為考察因素，其中接種量以質量分數計算，料水比和發酵菌種比例均以質量比值計算。參考以往研究者研究[18,20]以及實際生產條件設計各因素水平，發酵菌種水平選擇枯草芽孢桿菌NHS1（Bacillussubtilis）、乳酸菌NHS03（Lacticacidbacteria）、海洋紅酵母菌NHS05（Marineredyeast）三者不同比例（表1）。以發酵后豆粕的粗脂肪、還原糖、乳酸、中性蛋白酶、總氨基酸、干物質回收率、不飽和脂肪酸、粗蛋白為綜合指標。每個因素3個水平（見表1），按照L9（34）正交試驗表（見表2）制作總量為3kg的發酵豆粕，平均分成3份，分別裝入發酵袋中，密封培養，發酵時間為48h。各處理組以T1、T2、T3，…，T9表示。發酵完成后樣品進行低溫干燥（含水率為8.5%），進行指標測定。

　　2結果與分析

　　2.1正交試驗權重系數及綜合評分的確定

　　選擇L9(34）表，試驗方案及結果見表3，表4。由于本次正交設計采用了多個指標成分進行分析，所以采用多指標試驗公式法[28]進行數據處理。以Xij表示第i次試驗第j個指標的測定值（即Xij表示正交試驗的第i次試驗的第j個指標的測定含量），首先以各指標的最大值作為參照，對同一指標各數據進行標準化處理，Dij表示第j個指標下的第i個測定值的標準化數據。Dij=Xij/(Xj)max，其中i=1，2，...，9；j=1,2，...，8。再按各指標的重要程度和各組數據的相對標準偏差確定權重系數，Fj=Ej×RSD/RSDj（見表3），其中RSD為粗脂肪的相對標準偏差，RSDj為第j個指標的相對標準差，由于各營養指標的作用都比較重要，故重要程度Ej定為1。Pi=Σ(Fj×Dij）/ΣFj，計算所得的兼顧各項指標綜合評分公式Pi越大越好，數據處理結果見表5，表6。

　　2.2豆粕發酵工藝綜合評分結果與分析

　　本試驗選擇8種生產指標作為考察發酵豆粕綜合品質指標，通過多指標試驗公式法科學計算得出各指標的權重系數（見表3）。其中中性蛋白酶權重系數最高（1.773），說明中性蛋白酶對發酵豆粕品質影響較大，因此分配權重較大；而粗脂肪權重系數最低，說明粗脂肪對發酵豆粕品質影響較小，分配權重系數相對較小。再通過公式計算出各試驗組的綜合評分并對評分進行排序（見表4）。結果顯示：T9組綜合評分最高（0.9863），T1組綜合評分次之（0.9654），T7組綜合評分最低（0.8260）；T9組直觀排序為第1，因此在本試驗中T9組（A3B3C2D1）在各試驗組中發酵工藝最佳。綜合評分Pi的均值回應表（表5）顯示，正交試驗中各因素水平的均值以及極差，通過極差排秩可以直觀得出各因素對發酵豆粕綜合品質影響程度各不相同，D因素影響最大，C因素影響次之，A因素影響最小，因此各因素的影響程度依次為D>C>B>A，即發酵菌種>料水比>環境溫度>接種量。綜合評分Pi方差分析結果（表6）表明：各因素對發酵豆粕綜合品質影響顯著程度不同，D因素（發酵菌種）和C因素（料水比）P值分別為0.021和0.046，P值均小于0.05，為顯著影響因素；A、B因素的P值大于0.05，說明A、B因素對試驗結果沒有顯著影響，即接種量和環境溫度對發酵豆粕綜合品質的影響不大。因此，考慮節約試驗資源，T9組合（A3B3C2D1）中A因素選擇較低水平，B因素選擇與外界環境相符溫度。將發酵工藝A3B3C2D1最終優化為A1B2C2D1，即本試驗最終發酵工藝為：接種量1%，環境溫度30℃，料水比2∶1，發酵菌種枯草芽孢桿菌NHS1∶乳酸菌NHS03∶海洋紅酵母菌NHS05=1∶1∶1。

　　3討論

　　3.1發酵豆粕對抗營養因子以及氨基酸平衡等豆粕品質的影響

　　豆粕雖然在植物蛋白含量高、原料充足中等多方面存在優勢，但抗營養因子、氨基酸不平衡、適口性差和消化率偏低等因素限制了其應用。豆粕經過微生物發酵后，一方面能產生大量乳酸和芳香族化合物，改善飼料風味，適口性好，可增加動物食欲[41]。同時產生大量蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、糖化酶等消化酶，有助于提高豆粕的消化利用率[42]。何玉華等[43]研究發現乳酸菌發酵豆粕能夠顯著改善豆粕的風味和適口性，并在水貂日糧中添加23%發酵豆粕可有效提高有機物和粗脂肪的采食量。另一方面微生物發酵豆粕可去除多種抗營養因子[44]。劉媛媛[45]發現豆粕經發酵后胰蛋白酶抑制因子、大豆凝聚素、脂肪氧化酶、致甲狀腺腫素等均被完全降解。脲酶雖然是一種熱不穩定性的酶，但在某種特定條件下可以被激活，從而影響動物體內蛋白質的利用，甚至會危及動物生命[46]。豆粕中的胰蛋白酶抑制因子含量與其中的脲酶含量呈正相關關系，因此通過測定脲酶活性可間接評估豆粕中胰蛋白酶抑制因子含量[47]。本試驗中經過最佳發酵工藝發酵豆粕，脲酶基本消除，從側面說明胰蛋白酶抑制因子降解達到較高水平。另外，豆粕經微生物發酵后，使大分子蛋白分解為易吸收的小分子蛋白、小肽分子以及氨基酸分子。有學者利用枯草芽孢桿菌發酵豆粕后發現游離氨基酸差異顯著，大部分必需氨基酸有所增加，其中異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸較發酵前增加2～7倍[48]。本試驗中各氨基酸含量在發酵后均有不同程度增加，其中賴氨酸、精氨酸、蘇氨酸增幅相對較大，與Dai研究結果不同，可能與發酵菌種以及發酵工藝不同有關。

　　3.2多指標綜合加權評分分析法

　　多指標綜合評價是指人們根據不同的評價目的，選擇相應的評價形式，據此選擇多個因素或指標，并通過一定的評價形式，據此選擇多個因素或指標，并通過一定的評價方法，將多個評價因素或指標轉化為能反映評價對象總體特征的信息[49]。其中評價指標與權重系數的確定將直接影響綜合評價的結果[50]。在以往進行微生物發酵豆粕的工藝優化研究中，研究者一般只采取一個參考指標[42]，這樣就造成了試驗結果具有一定的片面性。本研究在指標的選取以及數據的處理等方面，引入了綜合分析指標的概念，將具有不同考察范圍的指標轉化為一個可以量化的數值。因此這種多指標綜合加權評分法可以較好的避免單一指標評價的片面性，從而使指標分析更加公正、全面，同時對關鍵性影響因素也給予了相應的側重，使結果分析更為科學、客觀。多指標綜合加權評分法在中藥提取研究中應用較廣[51-52]，而在微生物發酵方面的應用鮮有報導。目前在豆粕發酵工藝研究方面多利用正交設計以及響應面分析[53]，并多采用單一指標評價分析結果，最終得到最佳發酵工藝。按照權數產生方法的不同，多指標綜合評價方法可分為主觀賦權評價法和客觀賦權評價法兩大類。劉曉明[24]在研究乳酸菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌發酵不同飼料原料時采用了主觀賦權評價法，依據各指標對發酵飼料質量影響的大小給予不同的權重系數，這種方法主觀性比較強，易受人為因素的影響。而本研究中采用的是客觀賦權評價法，該方法能夠綜合考慮各指標之間的相互關系，依據各指標所提供的初始數據信息來確定權重，從而使評價結果更加精確，客觀性比較強，更具有說服力。

　　4結論

　　本試驗通過正交設計進行試驗，并檢測各項指標，利用多指標試驗公式法以及Minitab17軟件進行數據分析，得出最高綜合評分為0.9863，正交試驗第9組A3B3C2D1為擬選發酵工藝。由于A、B因素對試驗結果沒有顯著性影響，考慮節約試驗資源，因此選擇A1B2C2D1為最佳發酵工藝條件，即接種量為1%，環境溫度30℃，料水比為2∶1，發酵菌種為枯草芽孢桿菌NHS1∶乳酸菌NHS03∶海洋紅酵母菌NHS05=1∶1∶1。本研究得出的最佳發酵工藝是在實驗室條件下進行的，后續在產業化應用中進一步優化和微調，進一步改善發酵豆粕蛋白質品質，顯著降低抗營養因子含量，提高發酵豆粕的利用率。

　　[參考文獻]

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