摘　要 ：本試驗利用膠體金免疫層析技術原理，研制了布魯氏菌抗體檢測試紙條，并以布魯氏菌陽性血清國家標準品進行了敏感性試驗，確定了最低檢出量，同時與有可能存在交叉反應的血清和陰性血清進行了特異性試驗;然后將保存不同時間的試紙條在進行了敏感性和特異性試驗，證明其穩定期可以達到 15 個月。選擇臨床牛羊血清 30 份，利用該試紙條與布魯氏菌病虎紅平板試驗抗原進行同步檢測，發現兩種試劑的檢測符合率為 98%。試驗證明，所研制的布魯氏菌抗體檢測試紙條敏感性高、特異性強、穩定期長。

　　關鍵詞 ：布魯氏菌 ;脂多糖 ;膠體金 ;免疫層析 ;金黃色葡萄球菌 A 蛋白

　　布 魯 氏 菌 病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)侵入機體，引起傳染變態反應性的人獸共患細菌性傳染病 [1] 。本病發現至今已有 130 多年歷史，不僅沒有被消滅，近年來還有逐年上升的趨勢。該病分布廣泛，在全世界范圍內流行。布魯氏菌病是世界動物衛生組織(OIE)須通報動物疫病，為我國二類動物疫病 [2] 。布魯氏菌能感染人、多種家畜和野生動物，引起發熱、流產、睪丸炎、關節炎及神經損傷等臨床癥狀，嚴重危害人類健康與畜牧業發展，并且威脅公共衛生與食品安全，在國際貿易檢疫中為必檢傳染病之一 [3] 。

　　布魯氏菌為革蘭氏陰性菌，是一種胞內寄生的球形或短桿狀菌，無鞭毛和莢膜，不形成芽孢。布魯氏菌是專性需氧菌，最適生長溫度為 37 ℃，最適pH 6.6~7.4 [4] 。布魯氏菌分為光滑型(Smooth，S)和粗糙型(Rough，R)菌落，也有 S-R 中間型菌落。 S 型細菌中細胞壁含有 O 鏈的 LPS，而 R 型 LPS 中 O 鏈缺失 [5] 。根據宿主特異性，布魯氏菌屬分為 6 個種，分別是流產布魯氏菌(牛種)、馬爾他布魯氏菌(羊種)、豬布魯氏菌、綿羊布魯氏菌、犬布魯氏菌和沙林鼠布魯氏菌。最近又發現了 6 個新的布魯氏菌種，分別是鯨型布魯氏菌(B. ceti)、鰭型布魯氏菌(B. pinnipedialis)[6] 、田鼠種布魯氏菌(B. microti)[7] 、岐見瑪瑙寶螺種布魯氏菌(B. inopinata，又名意外布魯氏菌，指意外在人類身上發現)[8] 、狒狒種布魯氏菌(B. papionis)[9] 、赤狐種布魯氏菌(B. vulpis)[10] 。布魯氏菌抗原結構復雜，分屬內抗原和屬外抗原 [4] 。屬內抗原包括 A、M 和 R 等表面抗原。S 型布魯氏菌的抗原決定簇主要位于 LPS 的多糖鏈部分，為 A 和 M 兩種表面抗原。LPS是刺激機體產生抗體的主要有效成分， O 鏈在血清學診斷中起重要作用 [5] 。R 型布魯氏菌共同具有 R 抗原。S 型布魯氏菌表面抗原與小腸結腸炎耶爾森菌 O9、霍亂弧菌和大腸桿菌 O157 間有共同抗原成分 [4] 。

　　21 世紀以來，隨著畜牧業發展，布魯氏菌病在世界范圍內呈現出快速回升趨勢。布魯氏菌病疫情在全球分布廣泛，約有 1/5 的人口受到該病威脅，每年新發病例約 50 萬 [11] 。據有關數字統計，我國在 1996—2017 年，人的布魯氏菌病感染率從 0.09/100 000 上升到 2.79/100 000，是原來的 31 倍。人感染率的增加預示著動物疫情的加重 [12] 。我國近年來的布病呈現老疫區死灰復燃，新疫區范圍持續擴大，疫情小規模、多點散發的特點 [11] 。我國《獸醫公報》的數據顯示，2011 年我國家畜布魯氏菌病發病 125 030 例，2012 年發病 28 958 次，2015 年 23 個省份發病 [13] 。因此，研制快速便捷的抗體檢測試紙條，加強動物布魯氏菌病抗體水平監測特別必要。

　　1　材料與方法

　　1.1 試驗材料

　　布魯氏菌脂多糖(LPS)：本實驗室提取;布魯氏菌，牛羊陽性血清、陰性血清，大腸桿菌 O157、小腸結腸耶爾森菌、沙門氏菌、牛結核病陽性血清：中國動物衛生與流行病學中心提供。布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗陽性血清國家標準品、布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗抗原：購自中國獸藥監察所;硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜、PVC 膠板：購自上海金標生物;SPA、氯金酸：均為西格瑪產品。其他化學試劑均為分析純。

　　1.2 方法

　　1.2.1 布魯氏菌 LPS 的提取及純化　采用熱酚法提取，具體方法見參考文獻 [14]。

　　1.2.2 膠體金探針的制備　采用檸檬酸三鈉還原法，制備膠體金溶液。膠體金標記的蛋白為金黃色葡萄球菌 A 蛋白(SPA)。具體方法見參考文獻 [15]。

　　1.2.3 SPA 多克隆抗體的制備與純化　質控線抗原采用 SPA 免疫的兔血清。將 SPA 免疫健康兔，免疫 3 次后，采血，析出血清。血清的純化采用辛酸 - 硫酸銨沉淀法。具體方法見參考文獻 [14]。

　　1.2.4　試紙條的制備

　　1.2.4.1 質控線(C 線)與檢測線(T 線)的劃線條件優化　對 NC 膜上的 C 線和 T 線分別設置幾個濃度梯度，進行劃膜濃度摸索，確定劃膜濃度后，對包被條件從緩沖液、劃膜速度和劃膜寬度進行優化。

　　1.2.4.2 質控線(C 線)與檢測線(T 線)的劃線方法　首先，將 2.5 cm 寬的 NC 膜貼在 PVC 膜的中間對應位置。將純化好的 SPA 多克隆抗體按照摸索好的稀釋濃度稀釋后，裝入金標劃膜儀的噴頭 1，將提取的 LPS，按照摸索好的稀釋濃度稀釋后，裝入金標劃膜儀的噴頭 2;C 線與 T 線之間的距離設置為 4 mm，將貼在 PVC 板上的 NC 膜，固定在劃膜儀的合適位置，按開始鍵，進行劃線。將包被好抗原的 PVC 板放于 37 ℃溫室中干燥 2 h 后，放密封袋中保存。

　　1.2.4.3 試紙條的組裝與斬切　在相對濕度控制在 30% 的溫室中，進行試紙條組裝。取出包被有抗原的 PVC 板，取 3.3 cm 寬的吸水紙壓 NC 膜上端 2 mm，小心抹平，黏緊。0.6 cm 寬的金標墊上端壓 NC 膜上端 1 mm，1.9 cm 寬的樣品墊上端壓金標墊下方一半，每貼一種都要抹平黏緊。最后，在吸水紙上貼上綠色膠條，在金標墊上貼藍色 MAX 膠條，包裝完成。用高速斬切機切成 3 mm 寬的試紙條，加入干燥劑，放入鋁箔袋密封保存。

　　1.2.4.4 試紙條的結果判定　將試紙條放入稀釋好的血清樣品中，樣品用量不可超過 MAX 線，室溫下作用 5~10 min，觀察結果。質控線和檢測線均顯色，則為布魯氏菌抗體陽性;如果只有質控線顯色，則為陰性;質控線不顯色，該試紙條無效。

　　1.2.5 試紙條的鑒定

　　1.2.5.1　試紙條的敏感性檢測　布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗陽性血清國家標準品(4 000 IU/mL)用生理鹽水做倍比稀釋后用試紙條進行檢測，出現陽性信號的血清最高稀釋度作為試紙條的敏感性。

　　1.2.5.2 試紙條的特異性檢測　同一批次試紙條分別檢測牛羊布魯氏菌病陽性血清和陰性血清各 2 份，大腸桿菌 O157、小腸結腸耶爾森菌、沙門氏菌、牛結核病陽性血清各 1 份，觀察其特異性。

　　1.2.5.3 試紙條的重復性檢測　取同一批次及不同批次制作的試紙條分別檢測同樣的布魯氏菌病陰陽性血清，根據試驗結果評價試紙條的批內和批間重復性。

　　1.2.5.4 試紙條的穩定性檢測　取密封后置于室溫環境下保存 3、6、9、12、15 個月的試紙條進行檢測，根據試驗結果評價試紙條的穩定性。

　　1.2.6 試紙條與虎紅平板試驗比對　待檢血清樣品 60 份、陽性血清 30 份，包括 15 份牛血清和 15 份羊血清，陰性血清 30 份，包括 15 份牛血清和 15 份羊血清，分別采用該兩種方法，對 60 份樣品進行檢測，根據結果評價二者符合率。

　　2　結果

　　2.1 膠體金表征分析

　　采用檸檬酸三鈉還原氯金酸方法制備的膠體金溶液，在其他反應條件不變的情況下，濃度為 0.01% 氯金酸溶液中加入的檸檬酸鈉量與形成的膠體金顆粒大小呈反比，當在 100 mL 體系內快速加入 1.5 mL 1% 檸檬酸三鈉時，制備的膠體金顆粒大小約為 25 nm。制備的膠體金在自然光照下呈酒紅色，清澈透亮。制備的膠體金顆粒呈球形，分散性較好，顆粒大小均一。

　　2.2　試紙條的制備

　　2.2.1 C 線和 T 線條件優化　對 NC 膜上的 C 線和 T 線分別設置幾個濃度梯度，進行劃膜濃度的摸索，確定劃膜濃度后，對包被條件從緩沖液、劃膜速度和劃膜寬度進行優化。具體結果見表 1。

　　2.2.2　試紙條的組裝按照 1.2.4.3 的方法將試紙條組裝，使用時按照 1.2.4.4 方法判定。

　　2.3　試紙條的鑒定

　　2.3.1　敏感性檢測　布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗陽性血清國家標準品(4 000 IU/mL)用新生牛血清進行倍比稀釋后用試紙條進行檢測，結果顯示最低檢出量為 0.5 IU/mL(圖 2)。

　　2.3.2 特異性檢測　用膠體金試紙條檢測牛羊布魯氏菌病陽性血清和陰性血清各 2 份，大腸桿菌 O157、小腸結腸耶爾森菌、沙門氏菌、牛結核病陽性血清各 1 份。結果顯示，陽性血清均為陽性，陰性血清均為陰性，其他交叉菌均為陰性(圖 3)。

　　2.3.3 重復性檢測　用同一批試紙條檢測 10 份陰性血清和 10 份陽性血清，試驗重復 3 次，結果一致。用 3 個不同批次試紙條分別檢測 10 份陰性血清和 10 份陽性血清，結果一致。

　　2.3.4　穩定性檢測　于室溫環境下保存一批試紙條，分別于 3、6、9、12、15 個月，用同一批血清樣品進行檢測，發現保存 15 個月的試紙條顯色強度稍有減弱，仍能進行結果判定。

　　2.3.5 試紙條與虎紅平板試驗比對　待檢血清樣品共 60 份，陽性血清 30 份，包括 15 份牛血清和 15 份羊血清;陰性血清 30 份，包括 15 份牛血清和 15 份羊血清。分別采用上述兩種方法對 60 份樣品進行檢測，結果發現與虎紅平板凝集試驗陽性符合率為 100%，陰性符合率為 96.67%，總符合率為 98.33%(表 2)。

　　3　討論

　　布魯氏菌能引起人、家畜和多種野生動物患病，給畜牧業造成重大的經濟損失 [16] ，對人的健康造成重大的威脅，導致嚴重的公共衛生問題。

　　通過對血清抗體的監測發現，最早出現的抗體為 IgM，隨后是 IgG，再后是 IgA，持續 1 年左右開始下降;當病情反復發作時，IgG 又可以迅速回升 [1] 。

　　我國動物布魯氏菌病診斷技術國家標準(GB/T 18646-2002)介紹了 4 種布魯氏菌病血清學檢測方法，分別是虎紅平板凝集試驗、乳牛全乳環狀試驗、試管凝集試驗和補體結合試驗。其中，前兩種方法適用于家畜布魯氏菌病田間篩選試驗和乳牛場布魯氏菌病監測及診斷的初篩試驗，后兩種方法為我國動物布魯氏菌病的確診方法 [17] 。2018 年國家動物疫病監測與流行病學調查計劃中也提議，布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗、OIE 推薦的間接 ELISA 和熒光偏振試驗常被用于布魯氏菌病的初篩，試管凝集試驗或補體結合試驗或 OIE 推薦的競爭 ELISA 為布魯氏菌病的確診方法 [18] 。而在上述所提到的用于初篩的方法中，虎紅平板凝集試驗由于操作簡單、成本低廉，被廣泛使用。但該方法結果判定主觀性強，主觀差異性較大。乳牛全乳環狀試驗只適用于奶牛，且操作方法復雜;熒光偏振方法需要特定的儀器設備，且價格昂貴，難以在基層中推廣使用。布魯氏菌病的臨床診斷更傾向于一種簡便、快速、不需要特殊儀器設備，適用于臨床高通量檢測的診斷方法。膠體金試紙條憑借其操作方便和判定迅速的優勢，在動物疫病檢測中已得到較廣泛的應用 [19] 。目前國內取得新獸藥證書的布魯氏菌抗體檢測試紙條有 2017 年中國獸醫藥品監察所聯合 3 家生物制品公司申報的布魯氏菌抗體檢測試紙條，為一類新獸藥(農業部公告號 2526)。該產品申報名稱雖然為試紙條，但是以檢測卡的形式，采用了競爭抑制免疫層析的原理，特異性較高，但靈敏度稍差，漏檢概率較大。

　　本研究采用的是布魯氏菌抗體檢測試紙條，利用了間接法免疫層析原理，對國家陽性血清標準品的最低檢出量能達到 0.5 IU/mL，和文中有可能存在交叉的血清均沒有交叉現象，靈敏度和特異性均較高，和虎紅平板凝集試驗的符合率高達 98%，并且以試紙條形式，可以直接插入稀釋好的待檢樣品中，根據判定結果被時間直接讀取結果，簡單方便快捷。但是，不可否認的是，相比虎紅平板凝集試驗，價格成本相對較高;其次，由于在研制過程中，沒有加入濾血墊，因此不能進行全血檢測。

　　4　結論

　　本研究進行了試紙條的敏感性和特異性試驗，并與虎紅平板凝集試驗進行了比對試驗，結果標明該試紙條敏感性高、特異性好，且與虎紅平板凝集試驗具有很高的符合率，可替代虎紅平板凝集試驗抗原用于布魯氏菌病初篩。下一步有待于擴大樣本數，進行進一步考核，同時還有待于臨床試驗和實踐檢驗。

　　《布魯氏菌抗體檢測試紙條的研制和初步比較》來源：《中國動物檢疫》2018年10期，作者：齊安生;邵鈺;宮楓舉;張興進;張如民;朱紹輝;孫學強。