摘要 作為一種納米級別的囊泡，外泌體的相關研究近年來逐漸成為熱點。外泌體來源于細胞內的多囊泡胞內體，經由細胞膜釋放到細胞外。由于來自特定細胞類型的外泌體含有多種特異性的蛋白質和 microRNA，使其成為了可以廣泛用于疾病診斷及預后的新型生物標志物。相較于其他外源性藥物載體，外泌體具有更低的免疫原性，并能夠靶向作用于病變細胞。這使得由細胞天然產生或經過人工改造的外泌體作為一種新興的藥物載體具有良好的發展前景。特別是近幾年，外泌體在臨床應用領域的發展潛力不斷獲得拓展，針對腫瘤、糖尿病、心腦血管疾病、神經退行性病變等重大疾病，以外泌體為基礎的疾病診斷和藥物的研發都取得了快速的進步。本篇綜述重點介紹了外泌體作為一種生物標志物在疾病診斷和預后中的應用，同時闡述了外泌體作為一種新興的藥物載體所具有的優勢以及存在的問題。

　　關鍵詞 外泌體; 疾病診斷; 藥物載體

　　1 外泌體的生物學特征及功能

　　作為一種新近發現的細胞間通訊媒介，外泌體 ( exosomes) 的相關研究在最近幾年逐漸成為熱點。外泌體最早是從羊網織紅細胞培養上清中分離出來，隨后的研究確認了這種膜泡的特征、分泌途徑及其重要功能[1，2]。外泌體是直徑為 30 ～ 100 納米的膜泡結構，密度約為 1. 15 ～ 1. 19 g /mL[1，3]。外泌體的形成過程相對復雜[4]: 首先，在胞外環境刺激下，細胞發生內吞，其細胞膜向內凹陷出芽形成一個封閉的囊泡，稱為早期胞內體( early endosomes) 。隨后，早期胞內體逐漸成熟為晚期胞內體 ( late endosomes) 。在此過程中，其膜再次向內出芽并脫落，形成一系列內囊泡( intraluminal vesicles，ILVs) ，將細胞質基質中相應的蛋白質與核酸選擇性包裹其中。這種含有許多囊泡的胞內體稱為多囊泡胞內體 ( multi-vesicular endosomes，MVBs) 。多囊泡胞內體與質膜融合后，其中的內囊泡被釋放至細胞外，從而形成外泌體。當外泌體分泌之后，一般遵從以下 3 種通路與靶細胞互相作用: ( 1) 被鄰近的細胞捕獲 ( 或者被將它們分泌出去的細胞捕獲) ; ( 2) 被距離很遠的細胞攝入; ( 3) 參與到系統循環并被其他組織吸收[5]。

　　無論哪種細胞釋放的外泌體都攜帶若干標志性的蛋白質分子[6]。例如，參與多囊泡胞內體生物發生 的 分 子 TSG101 ( tumor susceptibility gene 101 protein) 和 ALIX( ALG-2 interacting protein X) 、熱休克蛋白 70 與 90( heat shock protein 70，HSP70; Heat shock protein 90，HSP90) 、膜聯蛋白 ( annexin V) 、Rab 家 族 蛋 白 質、四次跨膜蛋白質 ( CD9，CD63， CD81) 等。外泌體中還存在一些與其細胞來源相關的特定蛋白質，例如抗原呈遞細胞( B 細胞或樹突狀細胞) 所釋放外泌體中含有Ⅱ類主要組織相容性復合體( major histocompatibility complex class Ⅱ，MHC Ⅱ) ，或腫瘤細胞來源外泌體中含有腫瘤抗原，例如 MLANA / MART1( melanoma antigen recognized by Tcells 1) [1]。除了含有蛋白質外，外泌體還攜帶諸如 mRNA、非編碼 RNA 包括 microRNA 分子等，并且將這些分子轉運到靶細胞中。這一特點使得遺傳信息通過外泌體轉移到距離很遠的靶細胞成為了可能。外泌體以上的這些性質，為外泌體作為疾病診斷的分子標記物，以及用于生物治療的藥物載體提供了廣泛的理論基礎[7]。

　　2 外泌體作為診斷標記物的潛能

　　外泌體的特征之一是其中富集了其來源細胞特異性的蛋白質或 miRNA[8]。此外，外泌體可以從血液、尿液、唾液、羊水、惡性腹水、支氣管肺泡灌洗液和母乳等體液中分離出來。這些特征是外泌體作為疾病 診 斷 和 預 后 的 潛 在 生物標志物的研究起點[9，10]。

　　2. 1 外泌體所含 miRNA 作為診斷標記物的應用

　　miRNA 是一種小型 RNA 分子，廣泛參與細胞中各種轉錄后的基因表達調控，也存在于外泌體中[11]。當機體被疾病侵染時，引起血液、組織液等體液中特定 miRNA 高度表達，這些 miRNA 能夠借助外泌體的保護，防止被體液中廣泛存在的核酸酶降解。而這一特點也使得通過檢測外泌體中特定 miRNA 的含量來診斷疾病成為了可能。此前，諸多研究都致力于將外泌體中的 miRNA 作為一種生物標記物來診斷癌癥。例如，在鼻咽癌、胰腺癌等多種癌癥中，都有關于將外泌體攜帶的 miRNA 用以癌癥診斷的報告[12，13]。外泌體作為分子標記物的潛力不僅限于腫瘤。近年來，越來越多的研究旨在揭示外泌體所攜帶的 miRNA 與肌肉、脂肪等其他組織所涉及疾病的相關性。例如，Mateescu 等[14] 研究發現，胰腺細胞釋放的外泌體所攜帶的 miR-15a，通過誘導氧化應激增加糖尿病并發癥的發生率。該研究進一步指出，2 型糖尿病患者的胰腺細胞外泌體中的 miR-15a 可以作為糖尿病的并發癥，如視網膜損傷等疾病的診斷標記物。而在血液循環系統中的外泌體攜帶的多種 miRNA 都能作為疾病診斷的分子標記物。例如，血漿中的外泌體所攜帶的 miR126- 5p，在獲得性再生障礙性貧血和骨髓增生異常綜合征患者體內有顯著的上調趨勢，其表達量越高，患者生命周期越短，可以作為診斷這類疾病預后的生物標記物[15]。而在擴張型心肌病引起的急性心力衰竭的患者血清外泌體中，存在著 miR-92b-5p 明顯上調的現象，并且與患者疾病的嚴重程度呈現正相關的趨勢，是急性心力衰竭診斷的潛在標志物[16]。同時，血清外泌體所攜帶的 miR-122-5p、miR-196b-5p、 miR-301a-3p 和 miR-532-5p 在多發性硬化癥疾病患者中明顯下調。而同樣的現象也出現在患者的外周血單 個 核 細 胞 ( peripheral blood mononuclear cell， PBMC) 所釋放的外泌體中。這 表 明，外 泌 體 中 miRNA 可能是預測多發性硬化癥復發的潛在生物標志物[17]。這些研究表明，諸多疾病都會引起細胞釋放的外泌體所攜帶的 miRNA 出現特異性表達上調/下調，而這些特點揭示了外泌體可以作為疾病診斷的潛在分子標記物[18]。

　　2. 2 外泌體所含蛋白質作為診斷標記物的應用

　　除了外泌體所含 miRNA 可以作為疾病診斷潛在的分子標記物之外，在疾病進展中的某些病理性高表達蛋白質也會在外泌體中有所富集，使其能夠作為一種分子標記物進行疾病診斷[8，19]。例如 Tan 等[20]研究發現，在女性妊娠期血漿中的外泌體所含有的組織金屬蛋白酶抑制因子 1( tissue inhibitor of metallopeptidase-1，TIMP-1) 、纖溶酶原激活物抑制因子 1 ( plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1) 、胎盤生長因子( placental growth factor，PLGF) 3 種標記物能用于對先兆子癇的預測和篩查。與現有先兆子癇生物標志物相比，外泌體生物標志物具有更強的預測穩定性，足以在低風險的普通妊娠期人群中進行有效的先兆子癇篩查。在神經退行性疾病方面， Sardar 等[21]研究指出，阿爾茨海默癥認知功能的惡化與 β 淀粉樣蛋白在腦神經元中的高表達有關，而在阿爾茨海默癥患者大腦的神經元來源的外泌體中，存在 β 淀粉樣蛋白高度富集的現象。由于神經元外泌體在血液等體液中易于分離，并且含有特異性標記分子易于鑒定，因此，神經元外泌體可作為阿爾茨海默癥的診斷標記物。此外，在癌癥治療過程中，外泌體所攜帶的糖原磷酸化酶 ( glycogen phosphorylase，GP) 也可作為化療過程中多柔比星 ( Doxorubicin) 對心損傷的標志物[22]。以上發現均指出，外泌體作為一種細胞外微囊泡，在諸多疾病的診斷和預后中都發揮了關鍵性作用，外泌體在細胞間通訊所攜帶的諸多特異性蛋白質和 miRNA，都為疾病 早 期 診 斷 提 供 了 潛 在 的 標 記 物 和 靶點( Fig. 1A) 。

　　2. 3 以外泌體為標記物的臨床檢測平臺的發展

　　將外泌體作為診斷標記物的首要條件之一是建立一套準確、快速和靈敏度高的臨床檢測平臺。一直以來，外泌體檢測平臺都是圍繞流式細胞術為核心，對外泌體表面一系列特異蛋白質標記分子進行篩選和檢測[23]。而近年來，隨著外泌體在疾病診斷中的重要作用逐漸引起關注，對于外泌體的臨床檢測手段也取得了一系列創新性的發展。Guo 等[24]提供了一種基于微流控芯片進行外泌體檢測的新思路。在疾病診斷和檢測方面，相較于傳統的檢測方法，這類芯片具有體積小、高通量和高精度的特點，更適用于個體化醫療。而 Lee 等[25]研究發現，通過拉曼光譜學分析手段可將人血液來源的細胞外囊泡進行分類，進而對前列腺癌等癌癥進行診斷。此外，針對由大腦分泌進入血清中的外泌體，通過表面等離子 體 共 振 成 像 技 術 ( surface plasmon resonance imaging，SPRI) 能對其表征進行精準測量[26]。而針對于外泌體的量化研究，Kabe 團隊開發了一種名為 ExoCounter 的新型裝置，用于檢測各種類型癌癥患者血清中外泌體的確切數量，同時，對于外泌體中一些特異性標記分子進行量化檢測[27]。作者利用預先交聯在一個光盤表面的抗體去識別并結合外泌體表面抗原，從而將外泌體捕獲在光盤凹槽中，通過抗體偶聯的磁性納米珠進一步標記被捕獲的外泌體，并用光盤驅動器對被標記的外泌體進行計數。該系統的檢測靈敏度和線性度均高于 ELISA 或流式細胞術等傳統檢測方法，實現了準確可靠的液體活檢。總之，以外泌體為核心的臨床檢測平臺正處于快速發展之中，未來有望準確測定外泌體表面蛋白質的分布情況，并通過外泌體追蹤其來源細胞的病理狀態，從而為建立高效的以外泌體為基礎的疾病診斷體系提供強有力的技術支撐。

　　3 外泌體作為靶向藥物載體的應用

　　外泌體的內源性及其納米級別的體積，加之在細胞通訊中的重要作用，使得外泌體作為藥物載體擁有著其他載體分子難以企及的兩大優勢[28]。首先是其內源性，使得外泌體能夠通過血液循環系統順暢地到達身體的各個組織與器官，并可在不引發機體免疫反應的情況下釋放內容物[29]。其次是對于疾病發生期間細胞釋放的外泌體，其成分發生一系列變化，使外泌體膜表面或者囊泡內攜帶靶向識別病變細胞的蛋白質，這也使得利用外泌體進行靶向治療成為了可能[30]。總之，外泌體作為一種內源性的靶向藥物載體，有著廣闊的應用前景。

　　3. 1 天然產生的外泌體作為藥物治療疾病

　　部分細胞所自然產生的外泌體對于治療疾病有著巨大的潛質。Dong 團隊研究發現，人血清外泌體在體外能恢復缺鐵性肌營養不良細胞的細胞功能[31]。除此之外，間充質干細胞來源的外泌體能通過促進增殖，抑制細胞凋亡和調節免疫反應來介導軟骨修復[32]。同時，臍帶來源的間充質干細胞外泌體，通過活化血小板衍生的生長因子 D ( platelet derived growth factor D，PDGF-D) 來改善心肌細胞再生和促進血管生成[33]。值得注意的是，外泌體作為一種納米級載體，可不經修飾穿過血腦屏障。這使得將外泌體作為一種藥物載體治療部分腦損傷疾病成為了可能。Yang 等[34]研究指出，間充質干細胞釋放的外泌體可能用于治療創傷性腦損傷及其引發的神經性炎癥。而 Yuan 等通過研究發現，巨噬細胞來源的外泌體可以將大腦衍生的神經營養因子 ( brain-derived neurotrophic factor，BDNF) 輸送到腦神經元中，并且這一現象隨著腦炎癥的加劇而增強。這一發現為治療神經中樞疾病提供了一種潛在的載體[35]。而同樣作為載體的還有血紅細胞來源的外泌體，針對瘧原蟲侵染過后的人體，血紅細胞將數百種 miRNA 復合物通過外泌體轉移到寄生蟲內，這為靶向消滅惡性瘧原蟲侵染提供了一種思路[36，37]。

　　4 問題與展望

　　外泌體作為一種新興的診斷標記物及藥物載體，在應用方面還存在著許多挑戰。目前，將外泌體作為疾病診斷的分子標記物所存在的主要問題有兩個: 一是傳統方法獲得的外泌體純度和得率都較低，難以實現高通量的檢測; 二是目前缺少有效的快速檢測外泌體表征的技術方法。除此之外，外泌體在體外長時間儲存的方法也有待優化[43]。推薦閱讀：中醫活血化瘀法在婦科疾病中的臨床應用

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