摘 要 甘油和二甲基亞砜（簡稱“DMSO”）作為低溫保護生殖細胞的保護劑，是否能夠增強蠶卵的抗凍能力和延長蠶種保護期未見報道?‍‌‍?‍‌‍‌‍?‍?‍‌‍?‍‌‍?‍?‍‌‍?‍‌??‍?‍?‍‌‍?‍?‍?‍‌‍‌‍‌‍‌‍?‍‌‍?‍???‍?‍?‍?‍?‍?‍?‍‌‍?‍‌‍?‍‌‍‌‍‌‍?。為探究甘油或DMSO對蠶卵保存的效果，以大造蠶品種的即時浸酸卵、赤豆色卵及深赤豆色卵為材料，分別將蠶卵放入水及5%、10%、15%三種不同濃度的甘油和DMSO中保存，空白對照組不加任何東西，分別置于4 ℃和0 ℃條件下保存。實驗結果為：（1）即時浸酸卵，在4 ℃下放入5% DMSO保護劑中冷藏效果最佳，主要體現在冷藏20d、30 d、40 d、50 d的孵化率比對照組分別高12.05%、40.35%、334.78%、142.86%；在0 ℃下放入5% DMSO保護劑中冷藏效果最佳，主要體現在冷藏20 d、30 d、40d的孵化率比對照組分別高4.30%、33.33%、100%。赤豆色卵，在4 ℃下放入水和5% DMSO保護劑中冷藏效果較佳，在0℃下以5%甘油保護劑冷藏效果較佳，但比對照組的效果差。深赤豆色卵，在4 ℃下放入5% DMSO保護劑冷藏效果最佳，在0 ℃下以水和10%DMSO保護劑中冷藏效果最佳。（2）即時浸酸卵和赤豆色卵冷藏，4 ℃保護效果最佳；深赤豆色卵冷藏，0 ℃保護效果最佳。（3）對于即時浸酸的蠶卵，加了保護劑的孵化率高于對照組；對于赤豆色卵，保護劑對其效果不明顯；而對于深赤豆色卵，隨著冷藏天數的增加，保護劑的效果逐漸明顯。

　　關鍵詞 蠶卵；甘油；二甲基亞砜；防凍劑

　　中圖分類號:S884 文獻標識碼:A 文章編號:2095-1205(2020)09-01-05

　　1 前言

　　1.1 蠶種保存現狀

　　我國作為擁有悠久歷史的蠶桑大國，家蠶種質資源豐富，為家蠶遺傳育種和遺傳學研究提供了良好素材。為避免種質資源消失，建立種質資源庫顯得尤為重要，而研究家蠶種質資源保存對蠶業可持續發展具有重要意義。

　　蠶種冷藏是蠶種保護工作的重要措施，生產上蠶卵冷藏的方法主要有滯育卵冷藏法、不完全滯育卵冷藏法、冷藏浸酸種浸酸后的冷藏抑制處理及即時浸酸種浸酸后冷藏等。滯育卵冷藏的方法有單式冷藏和復式冷藏。廣東多采用單式冷藏，少數地區采用復式冷藏。單式冷藏適合在用種期不超過140 d的情況下采用，復式冷藏一般在用種期不超一年的情況下采用。如遇到蠶種供應有余，為減少損失，則采用復式冷藏。不完全滯育卵的冷藏方法如下：蠶卵產后在25 ℃、相對濕度75%～80%的條件下，經過45～62 h（2～3 d），卵色處于赤豆色到深赤豆色之間，此階段的蠶種可冷藏50～70 d。蠶卵產后在25 ℃、相對濕度75%～80%的條件下，經過72～120 h（3～5 d），卵色處于深赤豆色到固有色之間，此階段的蠶種可冷藏80～90 d。冷藏浸酸種浸酸后的冷藏抑制處理方法如下：浸酸后的蠶種在25 ℃條件下經過20～24 h，胚子發育到丙1至丙2階段時，經中間溫度13～15 ℃保護2 h后移入內庫以5 ℃冷藏，冷藏限期為30d左右[1]。

　　1.2 胚胎動物的保護研究

　　為保持物種的多樣性，物種的生殖細胞保存這一項工作十分重要。低溫保存生殖細胞可以抑制細胞的發育，使用保護劑可增強細胞的抗凍性、保持細胞的活性，在需要用細胞時解凍便可以恢復其活性，讓其繼續發育生長。文獻資料顯示，目前低溫保護生殖細胞的保護劑主要有甘油、二甲基亞砜、海藻糖、乙二醇。這些保護劑主要用于畜牧、水產、生命科學等方面研究。

　　畜牧方向，郝愛玲等[2]取公牛鮮精液，在4 ℃環境下加入甘油溶液保存6 d，從而篩選出有利于牛鮮精4℃保存的最佳甘油濃度為4%；王世銀等[3]使用2%、4%、6%、8%四種濃度的甘油、乙二醇和DMSO作為保護劑，將其添加至雞精液，結果顯示濃度為6%的甘油對雞精液冷凍保存的保護效果最好，且保護劑組合甘油+DMSO組冷凍保存的效果略好于其他組。

　　水產方向，丁淑燕等[4]取興國紅鯉精子加入8% DMSO保護劑，保存于-196 ℃液氮中，在37℃水浴鍋里水浴100 s解凍，凍存前后的精子密度和活動率均無明顯差異；程順等[5]在超低溫環境下冷凍保存大黃魚精子，以甘油為保護劑，結果顯示以5%～20%甘油保護劑保存大黃魚精子的效果較佳，其中甘油濃度為10%時效果最佳。

　　生命科學方向，邵同先等[6]取8份志愿者的精液凍存（-196 ℃）10 d，加入復方甘油保護劑，精液解凍激活后鏡檢，精子活力接近鮮精的水平；齊映亮等[7]選取健康羊膜分為4組，A組為空白對照組，B組為DMEM/甘油/ DMSO/海藻糖組，C組為DMEM/甘油/DMSO組，D組為DMEM/甘油組，冷凍保存后與新鮮羊膜比較，實驗結論為DMEM、甘油、DMSO、海藻糖可作為新型保護劑用于精液深低溫高活性保存。

　　從以上實驗可以看出，甘油和DMSO都具有抗凍能力，且增強了動物鮮精和健康羊膜的抗凍性；甘油和DMSO能在-196 ℃的超低溫條件下保護生殖細胞；甘油和DMSO混合使用也具有抗凍性；冷藏后的鮮精需水浴解凍。實驗證明，甘油和DMSO對血細胞、動物鮮精低溫保存有一定的作用。之所以選取甘油或DMSO作為保護液，是因為甘油是最早、最傳統的防凍液，主要運用于植物、動物胚胎、昆蟲的低溫防凍，或制造業的除凍劑。10%的甘油水溶液冰點為-1.6 ℃，30%的甘油水溶液冰點為-9.5 ℃。DMSO是一種含硫有機化合物，能夠降低細胞冰點，抑制細胞程序性死亡[8]。純DMSO的冰點是18.45 ℃，含水40%的DMSO在- 60 ℃不凍，且DMSO遇水、雪混合時會放熱。因此DMSO可作涂料等的保護劑，汽油、航煤的防冰劑，以及骨髓、血液、細胞低溫保存的保護劑等[9]。

　　1.3 研究目的及意義

　　蠶農根據歷年的養蠶數量、市場的需求制訂下一年的用種計劃，為適應用種計劃，20世紀80年代開始了蠶種冷藏浸酸技術研究。蠶種冷藏的主要作用是解除蠶卵滯育和抑制蠶卵的發育，以便結合養蠶計劃適時出庫催青，確保蠶種的孵化率及蠶發育的質量，待保護一定的時間后，通過浸酸的方法來解除滯育。然而生產過程中蠶種發放的規律性極差，常會遇到蠶種冷藏超過期限或者提前出庫的問題，這樣會導致其成為超期蠶種或者在浸酸時造成蠶卵的浪費，不利于蠶種的供應。因此，生產上需要更靈活的技術方法去適應長期大量養蠶的蠶種需求，冷藏浸酸技術需要更多樣性才能適應生產的需求。

　　經文獻查閱，目前僅有關于甘油或DMSO對動物生殖細胞的保存研究，未見對蠶卵的保存等相關研究文獻。Jun Kusu等[10]將家蠶五齡幼蟲卵巢器官芽取出，用不同濃度的甘油處理，在液氮中保存。將解凍后的卵巢移植到五齡雌幼蟲體內，根據寄主發育情況，五齡雌幼蟲的卵巢中有20%以上發育成帶卵殼的成熟卵。通過孤雌生殖激活，成熟卵開始胚胎發育，孵化出幼蟲。孵化出的幼蟲和正常的幼蟲一樣完成了胚胎后發育。以上實驗說明，甘油對家蠶低溫保存有一定的作用。為進一步探索甘油、DMSO對蠶卵保存的效果，初步篩選出甘油和DMSO保存蠶卵的條件，期望找出延長保存蠶卵的材料及方法，為蠶種冷藏保護研究提供數據依據。

　　2 材料與方法

　　2.1 材料

　　1.蠶卵品種

　　大造蠶卵，由華南農業大學蠶絲科學系提供。

　　2.試劑

　　甘油（由廣州化學試劑生產）、DMSO（由天津市大茂化學試劑廠生產）、純凈水。

　　3.設備

　　LRH-250 -HS恒溫恒濕培養箱、松下NR-C320 WP- S三門變頻風冷無霜節能多門大冰箱。

　　2.2 方法

　　1.試驗處理

　　家蠶在常規條件下飼養和保護，取其母蛾產的蠶卵，分三種處理。

　　（1）即時浸酸卵。將母蛾產下的卵置于25 ℃、相對濕度75%～85%的環境保護約20 h后，取蠶卵樣品進行即時浸酸，鹽酸比重為1.075，液溫為46 ℃，浸酸4.5 min；用流動水沖洗脫酸約30 min，晾干；將蠶卵隨機分為8 份，每份設3個重復；在管內分別加入水、5%甘油、10%甘油、15%甘油、5% DMSO、10% DMSO、15%DMSO，或不添加任何東西（作為空白對照組）；將放有蠶卵的管分別在4 ℃、0 ℃的條件下保存；定期（每隔10 d）將蠶種樣品取出?‍‌‍?‍‌‍‌‍?‍?‍‌‍?‍‌‍?‍?‍‌‍?‍‌??‍?‍?‍‌‍?‍?‍?‍‌‍‌‍‌‍‌‍?‍‌‍?‍???‍?‍?‍?‍?‍?‍?‍‌‍?‍‌‍?‍‌‍‌‍‌‍?。

　　（2）赤豆色卵。將蠶卵置于25 ℃、相對濕度75%～85%的環境保護，蠶卵發育至赤豆色時，取蠶卵樣品，將蠶卵隨機分為8 份，每份設3個重復；在管內分別加入水、5%甘油、10%甘油、15%甘油、5% DMSO、10% DMSO、15%DMSO，或不添加任何東西（作為空白對照組）；將放有蠶卵的管分別在4 ℃、0 ℃的條件下保存；從第40 d開始，定期（每隔10 d）將蠶種樣品取出。

　　（3）深赤豆色卵。將蠶卵置于25 ℃、相對濕度75%～85%的環境保護，當其發育至深赤豆色時，取蠶卵樣品，隨機分為8份，每份設3 個重復；在管內分別加入水、5%甘油、10%甘油、15%甘油、5% DMSO、10% DMSO、15%DMSO，或不添加任何東西（作為空白對照組）；將放有蠶卵的管分別在4 ℃、0 ℃的條件下保存；從第80 d開始，定期（每隔10 d）定期將蠶種取出。

　　2.冷藏后的處理

　　取出蠶卵，用恒溫水浴鍋在37 ℃下解凍10 s，分別洗凈甘油和DMSO，晾干。即時浸酸卵晾干，放入25～26 ℃、相對濕度75%～80%的恒溫恒濕人工氣候箱中催青至孵化；而赤豆色卵和深赤豆色卵采用冷藏浸酸法進行浸酸，鹽酸比重為1.092，液溫為47.8 ℃，浸酸5min。取出蠶卵在流動水中沖洗約30 min，晾干，放在25～26 ℃、相對濕度75%～80%的恒溫恒濕人工氣候箱中催青至孵化。

　　3.計算孵化率

　　計算實用孵化率。

　　2.3 數據分析

　　本研究采用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進行多因素方差分析，使用鄧肯氏新復極差檢驗法（DMRT法）進行多重比較。

　　3 結果

　　3.1 即時浸酸卵用不同保護劑保存的效果

　　即時浸酸卵用不同濃度的保護劑保存，實驗結果如表1。總體上看，4 ℃下冷藏的蠶卵效果較0 ℃的好；加了保護劑的蠶卵孵化率高于空白對照組，隨著冷藏時間的增加，孵化率逐漸降低；4 ℃和0 ℃下冷藏10 d的效果最佳，孵化率均在93%以上，特別是溫度在4℃時，孵化率為100%。4 ℃冷藏30 d，5%甘油、10%甘油、5%DMSO及10%DMSO的孵化率都在80%以上，比空白對照組分別提高了52.63%、52.63%、40.35%、45.61%。4℃下，5% DMSO保護劑的冷藏效果是最好的，主要體現在冷藏20 d、30 d、40 d、50d的孵化率比空白對照組分別提高了12.05%、40.35%、334.78%、142.86%；0℃下，5% DMSO、10% DMSO保護劑的冷藏效果最好，對于5% DMSO來說，冷藏20 d、30d、40 d的孵化率比空白對照組分別約提高了4.30%、33.33%、100%，對于10%DMSO來說，冷藏30 d、40 d的孵化率比空白對照組分別約提高了16.67%、76.67%。特別是4 ℃下，加水冷藏10～80 d的蠶卵一直都有孵化，只是孵化率低，孵化率最高出現在冷藏10 d，為100%；孵化率最低出現在冷藏70～80 d。

　　3.2 赤豆色卵用不同保護劑保存的效果

　　赤豆色卵用不同濃度的保護劑保存，實驗結果如表2。總體上看，加保護劑的蠶卵孵化率均達不到實用孵化率要求。4 ℃冷藏的蠶卵孵化率較0 ℃的高，但隨著冷藏時間的增加，孵化率逐漸降低，冷藏50 d的效果最佳；對于4 ℃來說，空白對照組的孵化率高于加了保護劑和水的，所以保護劑在4℃的冷藏中效果不佳，其中水和DMSO的效果較其他保護劑好，冷藏40 d以5% DMSO較好、冷藏50 d以10%DMSO較好，但變化規律不顯著；對于0 ℃來說，冷藏50 d的效果最佳，且用5%甘油保存孵化率達到83%，其中40～60 d，加了5%甘油保護劑的蠶卵保存效果最佳，而70～80 d，空白對照組和加水保存的孵化率逐漸增加明顯，空白對照組的孵化率從10%增加到73%，加水保存的蠶卵孵化率從7%增加到50%。

　　4 討論

　　4.1 不同試劑保護

　　對于不同方法處理的蠶卵、不同時期的蠶卵，分析數據可得DMSO保護劑的冷藏效果更佳、水次之。即時浸酸卵，4 ℃下，5% DMSO保護劑冷藏效果最佳，0 ℃下，10% DMSO保護劑冷藏效果最佳；赤豆色卵，4 ℃下，水和5% DMSO保護劑冷藏效果較佳，0 ℃下，5%甘油保護劑冷藏效果最佳；深赤豆色卵，4 ℃下，5% DMSO保護劑冷藏效果最佳，0 ℃下，水和10%DMSO保護劑冷藏效果最佳。

　　4.2 不同溫度保護

　　對于即時浸酸卵和赤豆色卵來說，4 ℃保護效果最佳；對于深赤豆色卵來說，0 ℃保護效果最佳。溫度對不同發育時期胚胎的保存效果存在差別，這可能與胚子耐低溫能力有關，有待進一步研究。

　　5 結論

　　對于用甘油和DMSO處理的蠶卵，赤豆色蠶卵使用冷藏的效果不明顯，而深赤豆色蠶卵隨著冷藏天數的增加，使用保護劑有一定效果，但孵化率沒有達到生產上實用孵化率90%以上要求，但對種質資源的保護保存仍具有一定科學意義。而對于已經解除滯育的蠶卵來說，保護劑具有一定的作用，特別是DMSO，增強了蠶卵的抗凍性?加水保存的蠶卵是否增強了抗凍能力尚待進一步研究。

　　參考文獻

　　[1]徐興耀,林健榮.吳泉,等.廣東蠶桑生產傳承與創新技術[M].北京:中國農業科學技術出版社,2014:108-113.

　　[2]郝愛玲,阿淑艷,鄭偉,等.不同甘油濃度對牛鮮精低溫保存的影響[J].中國奶牛,2007(10):33-34.

　　[3]王世銀,張偉,張兆旺,等.抗凍劑對雞精液冷凍效果的影響[J].江蘇農業科學,2011,39(3):260-262.

　　作者劉景瑞1 薛彬靜1 王 飛2 王葉元1 嚴會超1

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