摘要：類檸檬苦素是引起柑橘果酒后苦味的重要因素，綜述了類檸檬苦素的結構、功能、苦味產生機理以及近年來國內外脫除檸檬苦素類化合物的有效方法，為柑橘果酒脫苦工藝的發展提供依據。。

　　關鍵詞：柑橘果酒;檸檬苦素類化合物;脫苦;綜述

　　柑橘(Citrus)是世界第一大水果，我國是柑橘的主要原產國。2017年，我國柑橘種植面積為262.3萬hm2，產量達3931萬t，均排世界第一，目前栽種的品種主要有金橘、溫州蜜橘、椪柑、砂糖橘、臍橙等。柑橘的采收時期集中，經常會出現鮮果滯銷、柑橘賣難等情況，從而造成一定的經濟損失[1]。為了解決鮮果供過于求的問題，人們通常會將柑橘加工成食品，如柑橘罐頭、柑橘酒等。

　　柑橘果酒(CitrusFruitWine)是以柑橘為原料經酵母發酵產生酒精和相關風味物質的一種飲料酒。柑橘果酒具有典型性香氣，富含VA、VC和黃酮等活性成分，有利于人體的健康。目前柑橘果酒產業化加工較少，主要原因是柑橘加工后會產生苦味。這類苦味物質嚴重影響了柑橘果酒的口感，給消費者帶來不愉快的體驗[2]。柑橘中的苦味物質主要有2種，黃烷酮糖苷類化合物(Flavanoneglycosidecompounds，如柚皮苷、新橙皮苷、枸杞苷等)和檸檬苦素類化合物(Limonoids，如檸檬苦素、諾米林等)。柚皮苷苦味閾值較高，水溶液中閾值為20mg/L，主要存在于葡萄柚和苦橙中。檸檬苦素苦味閾值很低，水溶液中閾值為1.0mg/L，果汁中苦味閾值3.4mg/L，約為柚皮苷苦味閾值的20倍，因此柑橘果汁及果酒的“后苦”現象，主要是由檸檬苦素引起的[3-4]。該文主要概述近年來國內外有關柑橘果酒脫除類檸檬苦素苦味的最新研究進展，指出其存在的主要問題，并對其發展動態進行展望，以期為解決柑橘果酒加工苦味的瓶頸難題提供新思路，為我國果酒加工相關研究提供參考。

　　1檸檬苦素類化合物簡介

　　1.1檸檬苦素類化合物的結構

　　檸檬苦素類化合物也稱為類檸檬苦素，是蕓香科(Rutaceae)和楝科(Meliaceae)植物的主要次生代謝產物，是一類高度氧化修飾的萜烯類化合物。1841年，科學家從柑橘中首次分離得到檸檬苦素[5]，到了20世紀60年代，科學家通過化學和X射線衍射的方法，確認了檸檬苦素的結構[6]，得到其分子式為C26H30O8，相對分子質量為470。類檸檬苦素是立體結構的配位化合物，其原型結構包含或源自一種具有4，4，8-三甲基-17-呋喃類固醇骨架的前體。所有天然存在的柑橘類檸檬苦素都含有一個呋喃環，在C-17處與D環相連接，C-3、C-4、C-7、C-16和C-17處均含有含氧官能團[7]。檸檬苦素類化合物主要存在于柑橘的果實、種子中，種子中含量最高[8]。檸檬苦素類似物種類豐富，主要包括檸檬苦素(Limomin)、諾米林(Nomilin)、脫乙酰諾米林(Deacetylnomilin)、諾米林酸(NomilinicAcid)等[9]。迄今為止已分離出大約300種檸檬苦素類化合物，而在柑橘屬中已分離出38種檸檬苦素類似物和21種配糖體[10]。目前已經分離出的這38種檸檬苦素類似物中，表現出苦味的僅有6種，其中檸檬苦素的苦味最強[11]，其次是諾米林，類檸檬苦素的脫苦工藝就是將這些物質的含量降低。

　　1.2檸檬苦素類化合物的功能

　　檸檬苦素類化合物具有抗腫瘤、抗炎等生理活性[12]。Miller等[13]發現某些柑橘類檸檬苦素可抑制7，12-二甲基苯[a]炭疽桿菌誘導的口腔腫瘤發生。Wang等[14]通過試驗首次發現類檸檬苦素具有較高的抗氧化生物活性。Tian等[15]研究發現在體外培養的人乳腺癌細胞中，檸檬苦素類化合物可抑制雌激素受體陰性和陽性細胞的生長，具有抗癌細胞增殖作用。檸檬苦素類化合物在水果中以糖苷和苷元的形式存在，Poulos等[16]評價了其對2種人類癌細胞系(SH-SY5Y神經母細胞瘤和Caco-2結腸腺癌)以及一種非癌哺乳動物上皮中國倉鼠卵巢(CHO)細胞的毒性作用，通過3-[4，5-二甲基噻唑-2-酰基]-2，5-二苯基四氮唑還原和光學顯微鏡觀察，發現癌細胞暴露于苷元(即檸檬苦素、諾米林)后，活性顯著降低。SH-SY5Y細胞較Caco-2細胞對檸檬苦素更敏感，而非癌性CHO細胞在細胞數量和細胞形態上幾乎沒有變化，說明類檸檬苦素對腫瘤細胞具有較強的多方面殺傷作用，但對CHO細胞的殺傷效果相對較差。檸檬苦素除了具有上述功能外，還具有抗氧化、預防心腦血管以及利尿等功效。

　　1.3檸檬苦素類化合物的苦味產生機理

　　柑橘成熟后檸檬苦素含量非常少，新鮮的果實或者鮮榨的柑橘汁都沒有苦味，放置一段時間或者經過加工處理之后就會產生苦味。研究證明，果實正常成熟過程中，檸檬苦素前體物質檸檬苦素A-環內酯(LimonoidA-ringLactone，LARL)逐漸被檸檬苦素UDP-葡萄糖苷轉移酶(Limonoid-UDP-glycosylTransferases，LGT)糖基化為配糖體(LG)[17]，此時是不具有苦味的。而當果實受到一定的機械損傷等外界環境脅迫時，LARL在檸檬苦素D環內酯水解酶的催化下迅速轉化為具有強烈苦味的檸堿[3，18-19]。

　　2柑橘果酒中檸檬苦素類化合物的掩蓋或脫除方法

　　盡管檸檬苦素類化合物具有很多的生理功能，有利于人體的身體健康，但是其嚴重影響柑橘果酒的風味，從而制約柑橘果酒產業的發展。最大程度掩蓋或者脫除柑橘果酒中的苦味物質是發展該產業的關鍵。

　　2.1添加苦味抑制劑掩蓋苦味

　　苦味抑制劑主要是通過阻塞苦味受體、截斷苦味信號傳遞等方式來降低或消除苦味[20]。添加苦味抑制劑可以掩蓋柑橘果酒中的檸檬苦素類化合物產生的后苦味，起到有效麻痹味覺細胞，提高苦味感受閾值的作用[21]。蔗糖是常用的苦味抑制劑，但效果不明顯，而添加量過高會損害人體健康。β-環糊精由7個葡萄糖殘基以α-1，4-糖苷鍵連接而成，具有親水的外圍和疏水的內腔，在溶液中可與多種有機物形成包合物，研究表明其可用于掩蓋柑橘中的苦味[22]。0.05%~0.50%的β-環糊精對柑橘果酒脫苦效果較好。另外，新地奧明也是比較理想的苦味抑制劑。該物質是新橙皮苷脫氫獲得的一類黃酮物質，能夠起到掩蓋苦味、調和風味的作用。將新地奧明加入到果酒中，它能與檸檬苦素或諾米林競爭而結合到苦味受體分子上，最終使苦味閾值增大[23]。研究發現，柑橘果酒中添加60mg/kg的新地奧明，可以使苦味閾值從3.4mg/kg升高至6.8mg/kg[24]。

　　目前，市場上出現了許多新型甜味劑。新橙皮苷二氫查爾酮(NeohesperidinDihydrochalcone，NHDC)是一種黃酮類衍生物，從天然柑橘等植物中提取出來經過氫化而成[25]。這種甜味劑甜度是蔗糖的1500~1800倍，而且口感清爽、余味持久，改善口味及屏蔽苦味的功效極佳，常用來改善食品與飲料味道[26]。但是，目前單一的苦味抑制劑無法全面抑制檸檬苦素類化合物的苦味。

　　2.2優化工藝降低苦味

　　柑橘果酒的風味受很多工藝的影響，例如鮮果的成熟度和榨汁方式等。因此實驗室通常挑選比較成熟的柑橘，通過慢速打漿或者鈍刀打漿的方式讓成品更加清甜可口[27]。果肉的含量也需要嚴格控制，可以采用離心分離的方法去除果肉顆粒[28]。目前，低醇發酵、低溫貯藏是未來的發展趨勢，不僅滿足消費者對低酒精度飲料酒的需求，同時低醇發酵、低溫貯藏生產的柑橘果酒含有較少的檸檬苦素，成品酒的口感較好。研究表明，柚子果汁經濃縮和4℃貯藏4d，離心后檸檬苦素含量分別下降17%和31%[29]。

　　2.3吸附法脫苦

　　吸附法是商業上常用的脫苦方法，其操作簡單、成本低、處理時間短，處理溫度低、吸附過程中不產生其他的雜質?；钚蕴俊⒐枘z、離子交換樹脂等是生產中常用的吸附劑。但是吸附劑容易飽和、阻塞、再生時間較長，吸附后營養成分會有一定的損失。

　　Zhang等[30]首次以表面分子印跡聚合物(SMIPs)為吸附劑從檸檬汁中去除檸檬苦素。結果表明，與表面分子非印跡聚合物(SNiPs，8.12mg/g)相比，SMIPs(27.72mg/g)具有更高的吸附容量，并且該吸附劑對檸檬苦素具有更好的選擇識別作用，最終從檸檬汁中吸附了幾乎所有的檸檬苦素。張曉丹等[31]

　　通過單因素試驗和正交優化試驗，得出在4%樹脂、溫度25℃、時間25min、轉速100r/min的工藝條件下，椪柑酒中檸檬苦素和諾米林的含量分別降低了49.54%和33.69%，VC的損失率僅為25.12%，說明X16樹脂對苦味物質的脫除有顯著效果，并且對營養成分的損失較小。Bao等[32]采用大孔吸附樹脂EXA-45和LX-900對果汁進行吸附脫苦，發現EXA-45比LX-900具有更高的吸附容量和更快的吸附速率，表明EXA-45比LX-900的應用前景更好。因此在實際應用中，選擇高效的吸附材料有利于提高吸附性能和吸附效率。

　　2.4酶法脫苦

　　酶法脫苦主要是通過相應的酶作用于檸檬苦素，使之生成不含苦味的物質。酶法脫苦專一性強、效率高，并且對果酒中的營養成分損失少[33]。檸檬苦素脫苦酶主要有檸酸A-環內脂脫氫酶(LimonateA-cyclicLipidDehydrogenase)、檸檬苦素環氧酶(LimoninEpoxidase)、乙?；呀饷?Acetyl-lyase)、檸檬苦素醇脫氫酶(Limoninalcoholdehydrogenase)和反式消除酶(Transeliminase)等。將檸酸A-環內脂或檸檬苦素轉化為其他物質就可減輕苦味。檸酸A-環內脂脫氫酶可將檸酸A-環內脂轉化為無苦味的17-脫氫檸酸A-環內脂，檸檬苦素環氧酶可將檸檬苦素轉化為沒有苦味的脫氧檸檬苦素，檸檬苦素醇脫氫酶可以將檸檬苦素轉化為檸檬苦素醇，而反式消除酶則可將檸檬苦素轉化為沒有苦味的反-19-羥基黃柏酮酸[34]。這些酶對諾米林的作用方式與對檸檬苦素的作用方式相似，其中乙酰基裂解酶代替了反式消除酶作用于諾米林，將其轉化成黃柏酮。

　　果酒中含有大量的有機酸，pH值偏酸性，而檸檬苦素類化合物脫苦酶的最適pH值通常偏堿性，脫苦之前需要先調節柑橘果酒的pH值，而這將影響柑橘果酒的風味[35-36]。同時，利用酶法脫苦還需面臨酶的提取純化問題。若將產生這些酶的細菌細胞先固定化，再用于柑橘果酒的脫苦，可以減少酶的提純工作。目前，常用的細菌有球形節桿菌、假單胞菌和束紅球菌等[36]。高秋芬等[37]研究黑曲霉胞外酶對琯溪蜜柚果汁的脫苦作用，結果表明，經固態發酵12d，檸檬苦素的去除率達到27.7%;液態發酵10d，檸檬苦素的去除率達到30.8%。這說明黑曲霉胞外酶液可顯著降低檸檬苦素的含量，達到有效脫苦的目的，同時也可初步確定黑曲霉胞外酶液中含有檸檬苦素類脫苦酶，可用于柑橘成品脫苦。Hasegawa等[38]利用果糖、半乳糖和檸檬酸等廉價碳源制備了能代謝檸檬苦素的棒狀桿菌細胞，然后將棒狀桿菌細胞在丙烯酰胺凝膠中固定化，再用于開發生物脫苦技術。該工藝顯著降低了柑橘汁中的檸檬苦素和諾米林的含量，尤其是降低諾米林含量的效果理想，而且脫苦處理對檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、果糖、葡萄糖、蔗糖等其他柑橘成分無不良影響，可以用于柑橘果酒的脫苦。

　　酶法脫苦具有許多的優點，但是成品酶或菌種的篩選及培養主要還停留在實驗室階段。

　　2.5膜分離技術脫苦

　　膜分離技術也是目前研究較多的一種脫苦方式，其分離效率高、操作溫度低、處理量大，可用于連續化生產[34，39]。按照分離原理不同，可將合成膜分為濾膜和溶解-擴散膜。濾膜分離主要是根據分子量的大小來決定其是否可以通過膜孔徑，只有小于膜孔徑的分子或物質才可以順利通過膜。而溶解-擴散膜則主要是根據溶質分子在膜中的溶解性和擴散性進行分離。柑橘中檸檬苦素是非極性分子，呈電中性，可以溶解在液膜中，然后再通過擴散作用進入到溶液。研究顯示，在25℃時，溶解-擴散膜能將溶液中的檸檬苦素由55mg/L降到11mg/L，或從40mg/L降至8mg/L，營養成分的損失不超過5%[40]。與濾膜相比，溶解-擴散膜能將濃度極化現象降至最低，且具有很強的抗污染能力[34，41]。

　　2.6超臨界CO2脫苦

　　超臨界CO2技術脫除果酒中類檸檬苦素具有操作條件簡單、分離容易、提取速度快、活性成分和熱敏性成分不易被破壞等優點。孟鵬等[42]優化了金柑中檸檬苦素的超臨界CO2提取工藝參數，在萃取壓力33MPa、萃取溫度50℃、萃取時間2.2h的條件下，檸檬苦素的去除量達7.02g/kg。Patil等[43]從葡萄柚中提取檸檬苦素類化合物，確定了壓力、溫度、萃取時間、CO2流量及CO2給樣方式等最佳萃取條件，結果表明在483MPa、50℃、60min條件下，從柱頂向外注入CO2流量約為5.0L/min，檸檬苦素提取產量最高為6.3mg/g。但該方法需要超臨界高壓裝置、生產成本較高，不適合在工業上大規模生產使用。

　　2.7代謝法脫苦

　　研究人員發現晚期采收的柑橘榨出的果汁較早期采收的甜，受這一現象的啟發，學者們研究了加快柑橘中苦味物質代謝的方法[34，36]。徐仲偉等[44]選擇濃度為2000mg/L的乙烯利進行脫苦試驗，結果表明，用乙烯利處理果實5d，檸堿苦味可以降低44.9%。需要注意的是，乙烯利的濃度不能過高，否則檸堿會重新析出，且濃度控制不當也會導致爛果。植物激素也影響柑橘中類檸檬苦素的含量。研究表明，吲哚乙酸、吲哚丁酸、萘乙酸、2，4，5-三氯氧乙酸、脫落酸等生長素是諾米林合成的有效抑制劑。但是脫落酸的抑制作用能夠被細胞分裂素解除[45]，因此在果實成熟過程中可以噴灑植物激素降低果實諾米林的含量。

　　2.8基因工程脫苦

　　利用基因工程技術改良柑橘的延遲苦味性狀是一個新的突破口。通過轉基因手段引入酶基因，能夠將柑橘中具有苦味的物質代謝為其他非苦味的物質。

　　Kita等[46]從柑橘反照率中分離到一個能編碼檸檬酸二磷酸葡萄糖轉移酶(limonoidGTase，LGT)的cDNA克隆，研究了其對果實中檸檬酸苷積累的貢獻。結果表明，表達載體的體外轉化產物具有LGT活性。CitlGT作為單一拷貝基因存在于柑橘基因組中。在臍橙果實發育過程中，CitlGTmRNA對應的轉錄物數量的變化與檸檬酸苷含量的變化規律相同。這表明，CitlGT的轉錄調控了柑橘果實中檸檬酸苷元向葡萄糖苷的轉化。

　　在柑橘生長和成熟的過程中，LARL能夠在LGT基因的催化下轉變成了無苦味的檸檬苦素類似物[47]。在未來的脫苦技術中，有望將LARL的基因導入柑橘基因中，降解柑橘中的檸檬苦素。。

　　3小結與展望

　　柑橘果酒口感醇厚，風味獨特，又具有濃郁的酒香和果香，深受消費者青睞，但是類檸檬苦素對產品的影響制約了柑橘果酒產業的發展。脫除柑橘酒中類檸檬苦素的方法有很多，具有較好應用前景的方法也較多。例如添加苦味抑制劑可以較快速的掩蓋苦味;吸附法簡單易行，處理溫度低、時間短;酶法高效、快速，選擇性高;膜分離技術分離效率高、操作溫度低、處理量大，易于連續化生產，且由于材料化學的不斷發展，性能優良的膜材料也相繼問世，膜分離技術必將在柑橘脫苦中具有更大的發展前景?；蚬こ痰炔僮鲝碗s，暫時無法應用于工業化脫苦。

　　目前，在食品加工過程中優化工藝降低苦味仍是當下的研究熱點。隨著人們對健康要求的不斷提高，低醇發酵、低溫貯藏將成為未來柑橘果酒的發展趨勢，低醇發酵、低溫貯藏加工的果酒，不僅酒精度低，而且能更大程度地保存原果的風味。因此優化果酒發酵的工藝，開發營養、風味及功能俱佳的柑橘低醇果酒是目前研究的重點和難點。

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